養(yǎng)好細(xì)胞注意點(diǎn)（二）

（一）何時(shí)須更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中是否須添加抗生素。

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中可以添加抗生素。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL。

(二）貼壁細(xì)胞傳代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應(yīng)處理

一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì).。

（三）將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，離心速率多少

回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為 1 000 rpm，5~10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

（四）細(xì)胞的接種密度

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。

（五）細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級(jí)

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即為無(wú)菌狀況，*次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中避光保存。

（六）冷凍保存細(xì)胞的方法及冷凍細(xì)胞濃度

將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以含有DMSO*培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約1x10⁶/ml。。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍。次日保存到液氮中。 

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x10⁶ cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x10⁶ cells/ml vial 為宜。